RT-PCR
מתוך ויקיפדיה, האנציקלופדיה החופשית
RT-PCR (ראשי תבות של Real Time Reverse Transcriptase PCR), היא השיטה הרגישה ביותר לזיהוי ולכימות של ביטוי גנים.
במיוחד כאלה שמבוטאים בשכיחות נמוכה או כאשר כמות הרקמה שנמסרת לבדיקה היא קטנה. יש לשיטה חשיבות רבה בביולוגיה המולקולארית כאשר רוצים קביעה כמותית של מולקולות שמתבטאות רק מעט דוגמת הורמונים. כמו כן, יש למכשיר חשיבות בדיאגנוזה רפואית בכל הקשור לזיהוי של נגיפים וחיידקים, עמידות לכימותרפיה ועוד.
המכשיר פועל בשני שלבים: בראשון הופך אנזים מסוג רוורס טרנסקריפטאז mRNA ל-cDNA. בשלב השני עובר מקטע ה-cDNA הגברה ב-PCR.
כדי לכמת את ה-DNA שעובר הגברה מכניסים למבחנה שבה נמצא האמפליקון חומר פלורסנטי דוגמת SYBR-GREENE המסתפח ל-DNA ביחס קבוע למדי לאורך המולקולה ולמספר עותקיה. זיהוי סימון הדנ"א נעשה בעזרת מקור אור, דוגמת לייזר, שמוחזר באמצעות זהירה פלורסנטית. הזהירה הפלורסנטית מזוהה על ידי גלאי, ומועברת למחשב לניתוח. המחשב מצוייד בתוכנה שמאפשרת לו לקבוע מהו מספר מחזורי ה-PCR שנדרש לדוגמה לעבור בטרם עלתה הזהירה בו אל מעבר לרמת הרקע. ערך זה משמש להערכה כמותית של כמות הדוגמה.
הערכה כמותית נעשית בשני אופנים:
- באופן עקיף, ביחס לדוגמה של גן שהתבטאותו חיונית house keeping gene .כאשר ההנחה היא שגן שמתבטא יותר, הזהירה שלו תעלה באופן משמעותי על פני זהירת הרקע במספר קטן יותר של מחזורי PCR. את התוצאה המתקבלת מנרמלים עלידי חלוקת מספר מחזורי ה-PCR שעברה הדוגמה עד לזהירה משמעותית יחסית למספר מחזורי ה-PCR שעבר הגן במבחנת הביקורת.
- באופן ישיר, ניתן לכמת בהתבסס על עקום כיול ספציפי לגן. כאשר מכניסים כמות ידועה של גן למבחנה, ומודדים את מספר המחזורים שלוקח לכל כמות של דוגמה להגיע לזהירה משמעותית.
ישנן 3 שיטות נוספות לכימות של DNA: הספג דרומי, היברידיזציה In situ, מערכי DNA.
