RT-PCR

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RT- PCR è una tecnica che consente di amplificare un DNA partendo da un pool di RNA di un tipo cellulare. E composta da due tappe: 1 Retrotrascrizione dell' RNA 2 Amplificazione del cDNA ottenuto nella tappa 1. Gli RNA eucariotici sono adenilati in 3', questo significa che l'estremità 3' possiede circa 200 residui di adenina coda poli A aggiunti durante la maturazione dell'acido dall'enzima poli A polimerasi che non ha bisogno di uno stampo. Incubando l' RNA totale ( quindi contenente anche RNA ribosomiale) estratto da una cellula, l'enzima trascrittasi inversa, precursori deossiribonucleotidi trifosfato, tampone e ioni bivalenti Mg++ è possibile in presenza di oligo dT dare il via alla formazzione di un filamento di cDNA ( DNA copia), a partire dal primer che riconosce la coda di poli A secondo le regole della complementarità. L'oligo dT è una catena di circa venti residui di timina. Questo processo si chiama anneling. Il primer fornisce un 3'-OH che la trascrittasi inversa usa per allungare la catena usando come stampo il trascritto. Questa seconda fase, detta di allungamento avviene alla temperatura di di circa 50 ° C in 1 ora. Sintetizzato il primo filamento e tolta la trascrittasi inversa si aggiunge alla provetta il secondo innesco e la Taq polimerasi, un enzima con attività 5'→ 3' polimerasica privo dell'attività 3'→ 5' esonucleasica, incapace quindi di condurre la riparazione di bozze, che sintetizza il DNA complementare al filamento di DNA fatto dalla trascrittasi inversa. Ora inizia la seconda tappa prima enunciata, l'amplificazione del DNA. Se si conosce il gene che si vuole amplificare il secondo innesco dovrà essere specifico e complementare con l'estremità 3' di quel specifico gene. Se non si dispone di queste informazioni o se interessa l'amplificazione di tutto il DNA, il secondo primer sarà aspecifico in modo tale che si appai con l'estremità del primo filamento di DNA e di tutti i cDNA neosintetizzati. L' anneling del primer avviene circa in 30 secondi ad una temperatura che si calcola considerando 2° C per ogni A o T e 4° C per ogni C o G. Segue una fase di denaturazione a 95° C per 1 minuto che segna l'inizio di un'altra fase di replicazione condotta come prima descritto per entrambi i filamenti. Ripetendo svariate volte il procedimento si ottiene l'amplificazione dell'acido in modo esponenziale grazie all'ausilio di uno strumento detto Termocyclo che è una specie di portaprovette che viene messo in una cella con termostato con cui si può variare la temperatura interna alla cella . La Taq polimerasi funziona bene a 70° C es svolge la trascrizione in circa 30 minuti.