Real-time PCR
Wikipedia
Real time PCR även kallad kvantitativ PCR (q-PCR), är en molekylärbiologisk metod som används för att mäta mängden av visst m-RNA (transkript) i en vävnad eller en grupp av celler.
Metoden går ut på att mängden av transkriptet mäts i förhållande till ett universellt referenstranskript som existerar i de flesta celltyper (housekeepinggen). En vanlig housekeepinggen är GAPDH, som är namnet på ett enzym som deltar i ett essentiellt steg i glykolysen. Även beta-aktin används i många fall.
I detalj går processen till på det viset att RNA renas fram från vävnaden eller cellkulturen, därefter omvandlas RNAt till komplementärt DNA (cDNA) med hjälp av enzymet omvänt transkriptas (se RT-PCR). Detta steg är nödvändigt då RNA en mycket instabil molekyl som aldrig skulle tåla de höga temperaturer som är nödvändigt vid PCR. cDNA har en annan kemisk struktur men innehåller samma information.
Principen vid Real-time-PCR bygger till stor del på den vanliga PCR-tekniken där det templat som är av intresse amplifieras under processen. Resultatet blir miljontals identiska kopior av det DNA-fragment som är av intresse. Skillnaden ligger i att en speciell fluoroscerande molekyl (prob) tillsätts till reaktionsblandningen. Denna prob binder specifikt till DNA-fragment och utsänder ljus av en specifik våglängd. Ljusintensiteten detekteras av apparaturen och mängden DNA kan därigenom bestämmas.
