PCR
Wikipedia
PCR är en förkortning av engelskans Polymerase Chain Reaction; hela namnet säger att PCR är en kemisk reaktion i flera steg utförd med hjälp av ett enzym av typen DNA-polymeras. PCR är en inom den moderna molekylärbiologin mycket använd teknik för att framställa stora mängder av en viss DNA-sekvens. PCR är kanske den viktigaste upptäckten inom molekylärbiologin. Processen uppfanns av Kary B. Mullis som 1993, endast sju år efter den första publikationen, fick Nobelpriset i kemi för sin upptäckt. Idag används PCR både inom forskning och klinisk diagnostik.
Som metod simulerar PCR i någon mån cellens sätt att vid celldelning göra nya kopior av kromosomernas DNA-kedjor, men man har ersatt en stor mängd enzymer med en cykel av temperaturväxlingar. Det enda enzym som behövs är själva polymeraset, som bygger en ny nukleotidkedja med en redan befintlig sådan som mall. I vanlig PCR använder man normalt dubbelsträngat DNA som mall för att göra nya kopior av; detta DNA brukar benämnas templat.
Metoden kräver två korta DNA-snuttar kallade primers eller oligonukleotider; en som binder till vardera av ursprungs-DNA:ts strängar. Avståndet mellan dessa primers bestämmer hur stor den tillverkade DNA-kopian, amplikonet, blir. DNA-fragment mellan 100-5000 baspar brukar gå lätt att åstadkomma med denna metod.
PCR:s temperaturcykel börjar med att man denaturerar DNA-molekylens bägge strängar vid hög temperatur. När lösningen med de denaturerade DNA-strängarna får svalna kan primrarna binda till ändarna av den sekvens som ska kopieras (amplifieras). Enzymet DNA-polymeras bygger sedan en ny sträng av DNA med primern som start. Sedan börjar man om från början, smälter isär DNA-kedjorna och bygger nya. En normal PCR brukar köras i 20-30 cykler. Mängden amplikon ökar exponentiellt enligt 2n där n är antalet cykler.
För att denaturera de bägge strängarna används temperaturer på ca 95 grader Celsius, en temperatur vid vilken de flesta proteiner denatureras och så även DNA-polymeras från de flesta organismer. Man använder därför ett värmetåligt polymeras som ursprungligen kommer från arkén Thermophilus aquaticus och därför ofta benämns Taq polymeras. Idag är dock de flesta polymeras som säljs för ändamålet gentiskt modifierade, därför att det ursprungliga Taq polymeraset saknar korrekturläsningsförmåga vilket leder till en hög mutationsfrekvens.
[redigera] Olika former av PCR
- RT-PCR, Reverse Transcription PCR
Används för att amplifiera, isolera eller identifiera en känd sekvens. Fungerar som vanlig PCR men man utgår från RNA som görs om till cDNA.
- Q-PCR, Quantitative PCR, Kvantitativ PCR
Mäter mängden produkt från en PCR. Används för att ta reda på om en sekvens finns eller inte.
- QRT-PCR, Quantitative Real Time PCR
Man använder sig av fluorescens eller prober för att mäta mängden av amplifierad produkt i realtid.
[redigera] Se även
Wikimedia Commons har media som rör PCR
- RT-PCR
- real-time PCR
- http://www.gene-quantification.info - The reference in real-time PCR
