Zellaufschluss

aus Wikipedia, der freien Enzyklopädie

Als Zellaufschluss werden in der Biochemie Verfahren bezeichnet, bei denen Zellen zerstört werden, um an deren Inhalt (meist Proteine, DNA oder mRNA) zu gelangen.

Inhaltsverzeichnis 1 Aufschlussverfahren 1.1 Mechanische 1.2 Nicht-mechanische 1.3 Schutz der Proteine

[Bearbeiten] Aufschlussverfahren

[Bearbeiten] Mechanische

Mechanische Aufschlussverfahren führen meist zu einem Temperaturanstieg, deshalb muss die Temperatur kontrolliert werden und, wenn nötig, das Aufschlussgut im Eisbad gekühlt oder der Aufschluss mit Unterbrechungen durchgeführt werden.

Tierische Zellen und pflanzliche Zellen müssen vor dem Aufschließen von unerwünschten Gewebeteilen befreit werden, indem man sie zunächst mittels Schere, Skalpell oder Fleischwolf grob zerkleinert.

• Tierische und pflanzliche Zellen: Die Homogenisierung wird in einem Mixer mit rotierenden Messern (Ultra-Turrax bei kleinem Volumen) bewerkstelligt. Beide Verfahren können schäumen!
• Das Potter-Elvehjem Verfahren findet Anwendung, wenn die Zellorganellen erhalten bleiben sollen. Dabei bewegt sich ein Kolben, der eng von einem stationärem Gefäß ummantelt ist. Durch Scherkräfte werden die Zellen zerstört.
• besonders bei Mikroorganismen, aber auch allen anderen Zellen können kleine Volumina im Mörser mit Sand oder Al₂O₃ oder in einer Glasperlenmühle zerrieben werden. Durch Ultraschall werden die Zellen durch ständiges Aneinanderstoßen zerstört (Kavitationskräfte). Bei all diesen Verfahren wird bei Behandlung größerer Volumina viel Wärme entwickelt.
• Für kontinuierlichen Betrieb oder Volumina > 1000ml kann die Probe unter großem Druck durch ein enges Ventil gepresst werden (Manton-Gaulin-Homogenisator). Auch hier wirken Kavitationskräfte; der Aufschluss unter Druck im kleinen Maßstab geschieht mittels French-Press, die nach dem gleichen Prinzip wie der Manton-Gaulin Homogenisator arbeitet.

[Bearbeiten] Nicht-mechanische

Nicht-mechanische Aufschlussverfahren werden bei Zellen angewandt, die sich nicht einfach aufbrechen lassen (z.B. Hefe). Sie sind meist schonender als die mechanischen Verfahren.

• Tierische und pflanzliche Zellen: Durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen werden die Zellen durch Scherkräfte zerstört; durch Behandlung mit hypotonischen Pufferlösungen wird die Lyse der Zellen herbeigeführt. Beide Methoden führen allerdings zu keiner vollständigen Homogenisierung.
• Hefezellen: Autolyse mit Toluol ergibt Löcher in Zellmembran; die enzymatische Lyse mit Zymolyase zerstört die Glucan-Zellwand, während Triton X-100 die Zellmembran zerstört.
• Grampositive Bakterien: Durch die Behandlung mit Lysozym wird Peptidoglycanhülle zerstört, anschließend kann mit Triton X-100 die Zellmembran zerstört werden.
• Gramnegative Bakterien: Durch Behandlung mit EDTA werden Lipopolysaccharid der äußeren Zellmembran gelöst, dann wird durch die Behandlung mit Lysozym die Peptidoglycanhülle zerstört, anschließend kann mit Triton X-100 die Zellmembran zerstört werden.

[Bearbeiten] Schutz der Proteine

Durch den Aufschluss der Zellen gelangen die Proteine in eine unphysiologische Umgebung und müssen vor Inaktivierung, Denaturierung und Degradation geschützt werden.

pH-Veränderung durch metabolische Prozesse

• Ausreichende Pufferung
• Ggf. Nachstellen des pH-Wertes durch Zugabe von Ammoniak- bzw. Tris(hydroxymethyl)aminomethane-Lösung (Tris)

Inaktivierung durch Oxidation von SH-Gruppen

• Zugabe von Dithioerythritol oder 2-Mercaptoethanol zur Pufferlösung (im mM-Konzentrationen)

Schwermetallionen reagieren mit reaktive Gruppe des Proteins oder divalente Kationen (Ca²⁺, Mg²⁺) aktivieren abbauende Enzyme

• Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in mM-Konzentrationen zugeben (bildet Metallkomplexe mit Metallen)

Zu geringe Ionenstärke, <0.05M (schlechte Ausbeute, da sich Proteine an Zelltrümmer anheften)

• Aufschluss-Pufferlösung sollte ca. 0,05-0,1M Natriumchlorid oder Kaliumchlorid enthalten

Aggregation der Proteine (hydrophobe Wechselwirkungen)

• Zugabe von nicht-ionischen Detergentien wie Triton X-100 (ca. 0.02% w/v) oder Lubrol PX (ca. 0.006% w/v)

Proteasen werden während des Aufschließens freigesetzt

• Schnell arbeiten
• Temperatur nahe an 0°C halten
• Inhibierung durch Proteasehemmer (Tabelle mit Proteasehemmern z. B. inArbeitsmethoden d. Biochemie S. 47, Tab. 3-1 oder in anderer enschlägiger Literatur)

Eine gute Zusammenfassung zum Thema Zellaufschluss sich hier: http://www.digibib.tu-bs.de/?docid=00015123