Bunte Reihe (Labor)

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Bei der sog. Bunte Reihe handelt es sich um eine labortechnische Methode, um Bakterien zu identifizieren. Die älteste und kompakteste Version ist die kleine B. R. Die Identifizierung erfolgt über den Nachweis bestimmter Enzymaktivitäten, über den Abbau von Substraten oder den Nachweis bestimmter Fähigkeiten (Beweglichkeit). Der traditionelle Aufbau der kleinen Bunten Reihe (Identifizierung von Darmbakterien) ist von links nach rechts: Kligler-Agar, Harnstoff-Röhrchen, MIO-Röhrchen, Simmons Citrat-Agar.

[Bearbeiten] Überblick

Die Bunte Reihe besteht aus Reagenzröhrchen, die mit verschiedenen Nährmedien beschickt sind. Die Nährmedien enthalten Reagenzien und Indikatoren zum Nachweis von bestimmten Eigenschaften, die eine Bakterienspezies ausmachen. Beimpft werden die Röhrchen mit einer Impföse, mit dem nur eine Kolonie aufgenommen wurde (um die Spezifität des Tests zu erhöhen). Zuerst wird senkrecht in den Agar gestochen und danach auf der Schrägfläche im Zickzackkurs ausgestrichen. Da das MIO-Röhrchen weniger Agarose enthält, um den Bakterien die Wanderung zu ermöglichen, hat es aus technischen Gründen keine Schrägfläche. Anschließend wird zur Reinheitskontrolle ein MacConkey-Agar beimpft (die Kolonien müssen wie die am Vortag zum Test entnommene aussehen und es dürfen keine anderen auf dem Agar wachsen). Die Röhrchen und Deckel müssen vor dem beimpfen, wie die Impföse, kurz über einem Bunsenbrenner abgeflammt werden. Zum Indolnachweis wird nach der Ablesung des MIO-Röhrchens Ehrlich-Reagenz auf den Agar getropft. Die Ergebnisse (positiv/negativ) werden mit einer Tabelle verglichen und so kann man mit einer bestimmten Wahrscheinlichkeit den Keim einer Spezies zuordnen. In den meisten Fällen sind so die häufigsten Darmbakterien schnell zu identifizieren, jedoch gibt es Ausnahmen und Unregelmäßigkeiten, wie sie in der Natur vorkommen können. Genauer ist die Untersuchung mittels API wo 20 bis 30 biochemische Untersuchungen innerhalb von 24 Stunden durchgeführt und elektronisch ausgewertet werden können.

[Bearbeiten] Einzelne Tests

[Bearbeiten] Kligler-Agar

Nachweis von:
- Laktase (laktosespaltendes Enzym)
- Gärung in Form von CO₂-Bildung
- H₂S-Bildung

Zusammensetzung:
1 % Laktose (Substrat)
0,1 % Dextrose (Substrat)
Phenolrot (Indikator)
Eisenammoniumcitrat (Reagenz)

Reaktionen Durch den Dextroseabbau entsteht Säure und Phenolrot wird beim pH < 7 gelb. Nach Oxidation der Schrägfläche durch den Luftsauerstoff wird der Agar im oberen Bereich realkalisiert (pH steigt über 7) und die Schrägfläche wird rot), außer es wird auch Laktose gespalten (Säurebildung!), dann bleibt der gesamte Agar durch den Säureüberschuss gelb.

Geschieht dies ohne Verwendung von Sauerstoff (Gärung), so bildet sich CO₂, was als kleine bis große Luftblasen und Risse im Agar sichtbar wird.

Das gebildete H₂S reagiert mit dem Eisenammoniumzitrat zu Eisensulfid, was als schwarzer Niederschlag ausfällt.

Ergebnisse:

gesamter Agar gelb: Laktase-Aktivität positiv
Agar gelb und Schrägfläche rot: Laktase-Aktivität negativ
Luftblasen: CO₂-Bildung positiv
Schwarzer Niederschlag am Boden: H₂S-Bildung positiv

[Bearbeiten] Harnstoff-Röhrchen

Nachweis von:

Urease (harnstoffspaltendes Enzym)

Zusammensetzung:

Harnstoff (Substrat)
Phenolrot (Indikator)

Reaktionen Der Harnstoff wird durch das Enzym Urease abgebaut, wodurch ein alkalisches Milieu entsteht und der Indikator zu rot umschlägt.

Ergebnisse:

roter Agar: Urease-Aktivität positiv

[Bearbeiten] MIO-Röhrchen

Nachweis von:

Beweglichkeit (engl. Mobility)
Indolbildung
Ornithinsäuredecarboxylase (ODC)

Zusammensetzung:

Tryptophan (Substrat)
Ornithinsäure (Substrat)
Dextrose (Substrat)
Bromkresylpurpur (Indikator)

Reaktionen Die Beweglichkeit wird durch eine Trübung des Agars nachgewiesen. Verursacht wird diese Trübung durch die eingewanderten Bakterien.

Tryptophan wird enzymatisch zu Indol abgebaut, das mit dem Kovacs-Reagenz nachweisbar ist, es wird jedoch erst nach der Inkubation manuell hinzugegeben.

Bromkresylpurpur färbt den Agar durch den Abbau von Dextrose gelb (pH < 5,6). Wird die Ornithinsäure durch die Ornithinsäuredecarboxylase abgebaut, steigt der pH wieder an und der Agar wird wieder lila (Realkalisierung).

Ergebnisse:

nur der Stichkanal ist trübe: keine Beweglichkeit
Trübung außerhalb des Stichkanals: bewegliche Bakterien
Kovacs-Reagenz verfärbt sich rot: Indolbildung positiv
Agar ist lila: ODC-Aktivität positiv
Agar ist gelb: ODC-Aktivität negativ

[Bearbeiten] Simmons Citrat-Agar

Nachweis von:

Fähigkeit Citrat als einzige Kohlenstoffquelle zu verstoffwechseln

Zusammensetzung:

Ammoniumzitrat (Substrat)
Bromthymolblau (Indikator)

Reaktionen Wenn Ammoniumcitrat als Stickstoffquelle genutzt werden kann, steigt der pH-Wert durch Ammoniumfreisetzung an und Bromthymolblau wird blau (Ausgangsfarbe ist grün).

Ergebnisse: