Western blot
Wikipedia
Western blot, WB, är en vanlig molekylärbiologisk metod som används inom proteinkemin för att detektera och identifiera specifika proteiner med hjälp av antikroppar. Western blot används i princip vid alla laboratorier som bedriver biomedicinsk och biomolekylär forskning, men även vid klinisk diagnostik i vissa sammanhang.
[redigera] Tillvägsgångssätt
Det första steget vid en WB-analys är att rena fram proteininnehållet från de celler som ska studeras, en procedur som vanligtvis kallas för att lysera cellerna. Lysering av celler går ut på att cellmembranet löses upp med hjälp av en detergent, därefter utnyttjas centrifugering för att separera proteinerna från lipider och andra cellstrukturer.
Proteinlysatet blir därefter föremål för SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulphate Polyacrylamide gel electrophoresis) som är en teknik vars syfte är att separera proteiner av olika storlek. SDS binder och denaturerar proteiner, samt gör dem negativt laddade. Ett elektriskt fält utnyttjas för att separera proteinerna.
Nästa steg blir att överföra proteinerna av intresse till ett nitrocellulosamembran med hjälp av en elektrisk spänning. När proteinerna väl har överförts appliceras en specifik antikropp (primär antikropp) mot membranet, vars specificitet gör att det binder till proteinet av intresse. Därefter appliceras en sekundär antikropp som ofta är länkat till ett enzym vars katalytiska förmåga kan omvandla ett substrat till en produkt som kan detekteras med en luminometer.
