Endotoxina

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É uma toxina que é parte integrante da parede celular de algumas bactérias e só é libertada após a destruição da parede celular da bactéria. As endotoxinas são menos potentes e menos específicas que a maioria das exotoxinas. São também chamadas toxinas intracelulares.

Validação do método: Validação do teste LAL objetivando liberação de produto terminado quanto a limite de endotoxinas, envolvendo medicamentos, correlatos e biológicos, abrangem a comprovação da sensibilidade do LAL e a determinação de efeitos inibidores ou exacerbantes provocados pelas substancias integrantes da amostra.

Sensibilidade do lisado: Embora sistema de teste empregando como ponto final da reação a gelificação seja o de escolha dos compêndios e o mais freqüentemente adotado, métodos quantitativos têm evidenciado melhoria no gerenciamento de informações. Embora lisados comercialmente disponíveis possam confiavelmente detectar menos que 0,25 UE/mL, o limite de endotoxina no teste em coelhos tem sido de 5,0 UE/mL definido na base de dose, e 0,5 UE/mL definida pelo FDA em se tratando de concentração para parenterais de grande volume. Deve ser lembrado que o teste em coelhos avalia a presença de endotoxina e outras substâncias que promovam reação febril e o ensaio LAL mede exclusivamente a concentração de endotoxinas. A sensibilidade do Reagente LAL é avaliada utilizando série de diluição do Padrão de Referência de Endotoxina (PRE) ou Padrão de Endotoxina (PE) com razão geométrica igual a 2, para obter as concentrações de 0,25λ, 0,5 λ, λ e 2 λ, em que λ é a sensibilidade do reagente LAL, em UE/mL, apresentada em sua rotulagem. Todas as diluições devem ser feitas com água apirogênica, como Água Estéril para Injeção USP, e utilizando materiais apirogênicos. O teste deve ser executado com as quatro concentrações do padrão, em quadruplicata, e incluir controles negativos, que asseguram a condução adequada do procedimento. Os pontos finais serão determinados de acordo com as instruções do fabricante do reagente. Os resultados são considerados em conformidade se a média geométrica da concentração do ponto final for ≥ 0,5 λ e ‹2 λ.

Testes de Inibição e Exacerbação de Resposta: O ensaio LAL é baseado na reação de coagulação em seqüência de enzimas, induzida pela endotoxina. Então, não surpreende encontrar produtos que provoquem a inibição ou que potencializem a reação. Muitas destas substancias são compostos de peso molecular relativamente alto formados de unidades repetitivas, com elevada incidência de polissacarídeos. É importante o conhecimento de que estas substâncias não são no geral constituintes inerentes aos produtos, particularmente no caso dos parenterais de grande volume e dos correlatos de medicamentos, sendo eventualmente no caso de fármacos. Assim, a inibição ou a potencialização devem ser determinadas para cada formulação antes que seja empregada a metodologia para liberação final do produto. A determinação consiste em contaminar a concentração mais usada do fármacocom padrão de endotoxina (PE) para obter concentrações finais de 0,5 λ, λ e 2 λ. O teste deve ser executado, em quadruplicata, e incluir controles negativos. Em paralelo, e em duplicata, as mesmas concentrações (0,5 λ, λ e 2 λ) do padrão de endotoxina (PE) em água devem ser testadas. Os resultados são considerados válidos se a média geométrica da concentração do ponto final for ≥ 0,5 λ e ‹2 λ. Se o produto não diluído for inibitório, deve se proceder a sua diluição, respeitando o valor da diluição máxima válida (DMV). A inibição ou exacerbação, características de derivados sanguíneos polinucleotídeos, soluções contendo metais pesados ou tensoativos, produtos com elevada força iônica ou osmolaridade, pode ser eliminada com diluição, aquecimento, ajuste de pH, adição de substância que neutralize a inibição ou adição de agente dispersante de endotoxina.

Teste de Compatibilidade do Produto: Para efetuar a avaliação de inibição ou potencialização provocada por um produto, testes prévios devem ser conduzidos, por meio de um dos vários métodos. Qualquer esquema de teste deve respeitar a não interferência do produto. Caso seja em primeira instância detectada a interferência do produto no desenvolvimento do teste, mecanismo auxiliar consistirá em aplicar a concentração máxima válida ou diluição máxima válida, as quais estarão delimitando condições da aplicabilidade do teste in vitro, seja conciliando diluição ainda válida ou sensibilidade do sistema.

Concentração Máxima Válida (CMV): A determinação de concentração máxima válida, particularmente útil quando da existência de limites endotóxicos em monografia ou listagem do FDA, consiste em etapa preliminar para determinação da diluição máxima de um produto na qual a concentração limite de endotoxina possa ser detectada.

CMV = λ M

             k

onde: λ = sensibilidade do reagente LAL em unidades endotóxicas por volume de diluente (UE/mL); M = dose máxima humana ou em coelhos, recomendada pó Kg; K = 5,0 UE/Kg para fármacos parenterais no geral e 0,2 UE/Kg para fármacos de administração intratecal. O exemplo seguinte ilustra o uso da fórmula CMV: Produto: Ciclofosfamida Dose máxima: 25,0 mg/Kg Sensibilidade do lisado: 0,25 UE/mL, conforme rótulo do fabricante

CMV = λ M = 0,25 UE/mL × 25 mg/Kg = 1,25mg/mL

                                            K                   5 UE/Kg

Diluição Máxima Válida (DMV) Uma vez determinada a CMV, a diluição máxima válida pode ser calculada. Este valor é definido pela potência do produto dividida pela CMV. Para fármacos administrados na base de peso por quilograma, a potência do fármaco é expressa em miligramas ou unidades por mililitro, e para fármacos administrados na base de volume por quilograma, a potência é igual a 1,0 mL/mL. Apresenta-se a seguir exemplo de cálculo de DMV, empregando potência dos produtos e sua CMV:

DMV = potencia do produto = 20 mg/mL = 16

                                                           CMV                1,25mg/mL

O valor da DMV indica que o produto pode ser diluído em 1:16 para superar o problema da inibição, se necessário, considerando a sensibilidade do LAL, a potência do fármaco, a CMV e a dose. O exemplo seguinte ilustra o uso das fórmulas de CMV e DMV para um fármaco administrado em volume por base de peso. Produto: dextrose 5% em água Dose máxima: 10mL/Kg Sensibilidade do lisado: 0,25 UE/mL Potencia do fármaco: 1,0 mL/mL (administração na base de volume por volume corpóreo).

CMV = 0,25 UE/mL × 10mL/mL = 0,5 mL/mL

                                                            5,0 UE/Kg

DMV = potência do produto = 1,0 mL/mL = 2

                  CMV                 0,5 mL/mL

Então, dada a sensibilidade do reagente LAL usado, o produto pode ser diluído a 1:2 para contornar a inibição. Na realidade, dextrose 5 % não apresenta característica inibitória. A importância da sensibilidade do LAL neste contexto pode se demonstrada pelo uso da DMV na ciclofosfamida, usando um reagente com 0,065 UE/mL:

CMV = λ M = 0,065 UE/mL × 25 mg/Kg = 0,325mg/mL
                                           K                   5,0 UE/Kg

DMV = potência do produto = 20mg/mL = 61,5

              CMV               0,325mg/mL

Aumentando a sensibilidade do reagente LAL em aproximadamente quatro vezes, a DMV foi simultaneamente aumentada, elevando de 16 para 61,5. quando a inibição pelo produto consistir em problema, este pode freqüentemente ser contornado empregando reagente LAL de maior sensibilidade, que permite maior diluição do produto para eliminar a inibição. Pode-se adotar cálculo simplificado:

DMV = c K

             λ M

Onde c é a concentração do fármaco, K e M permanecem os mesmos dos exemplos anteriores e λ varia com a sensibilidade do reagente LAL. O exemplo seguinte será para ilustrar a aplicação da fórmula simplificada: Produto: fenitoina sódica Dose máxima: 15 mg/Kg Sensibilidade do lisado: 0,25 UE/mL Concentração do fármaco: 50 mg/mL DMV = K = 50 mg/mL × 5 UE/Kg = 66,6

  λM  0,25 UE/mL × 15 mg/Kg

Dada a sensibilidade do reagente LAL, a fenitoína pode ser diluída a 1:66,6. Conforme a conveniência, a diluição pode ser a nível aceitável, como 1:50, 1:40, 1:20 ou 1:10, na dependência de uma combinação particular fármaco- LAL.

Diluição Máxima Válida para Produto com Limite Oficial: No caso de existência de limite em monografia (USP XXIII) ou em listagem publicada pelo FDA, basta que se calcule, em etapa única, a DMV:

DMV = Limite Endotóxico x Potência do Produto Λ

Para soluções parenterais administradas com base em peso corpóreo, a potência é expressa em miligramas ou unidades por mililitro; para drogas administradas com base em volume corpóreo, a potência é 1,0 mL/mL; para fármacos administrados tendo por base a superfície corpórea, emprega-se 1,80 m2 para cálculo da dose total, dividindo-se por 70 para obter a dose por quilograma.

Abrangência da Validação: O fabricante de produto farmacêutico, biológico ou correlato objetivando empregar o teste LAL deve obter dados quanto a sensibilidade, inibição/potencialização e, se adequado, teste de sensibilidade da colônia de coelhos a ser empregada. Caso endotoxina diferente da E. coli 055:B5 seja empregada no sistema de teste, deve ser calibrada frente a ela.