Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
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L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide (en anglais : Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis ou PAGE) est une application de l'électrophorèse de zones, elle est très utilisée pour l'étude des protéines ou pour le séquençage de l'ADN.
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[modifier] Utilisation
Un gel de polyacrylamide est une matrice de séparation utilisée en électrophorèse de biomolécules, telles que les protéines ou les fragments d'ADN. Les techniques traditionnelles de séquençage de l'ADN telles que les méthodes de Maxam-Gilbert ou de Sanger utilisent les gels de polyacrylamide pour séparer des fragments d'ADN qui ne différent en logueur que par une seule paire de base pour que la séquence puisse être lue. Des méthodes de séparation de l'ADN plus modernes utilise maintenant des gels d'agarose, mais pas pour des fragments particulièrement petits. C'est actuellement la méthode la plus souvent utilisée en immunologie et en analyse des protéines, souvent utilisée pour séparer différentes protéines ou isoméres de la même protéine en des bandes séparées. Celles-ci peuvent alors être transferrées sur une membrance de nitrocellulose ou de PVDF pour être mises en contact avec des anticorps et marqueurs correspondants, comme dans un Western blot.
[modifier] Composition
Les gels de polyacrylamide peuvent varier en composition. Ils peuvent être faits avec differents pourcentages d'acrylamide, ce qui change le caractère de polymérisation, et donc la densité de la matrice du gel. Des niveaux supérieurs de polymérisation aboutissent à une structure de gel plus dense, ce qui permet une meilleure séparation des protéines. Des niveaux plus bas minimisent la rétention des protéines, mais sont souvent requis pour séparer des protéines de poids moléculaire proche. Ces gels sont utiliser pour mesurer visuellement les poids moléculaires des protéines par rapport à des protéines dont ceux-ci sont connus.
[modifier] Gels de séparation
Typiquement les gels de séparation sont faits à 6%, 8%, 10%, 12% ou 15%. Un gel de concentration (stacking gel) (5%) est coulé en haut du gel de séparation et un "peigne" (qui définit les pistes où les protéines, tampon de l'échantillon et échelle de poids moléculaire seront placés) est inséré. Le pourcentage choisi dépend de la taille de la protéine que l'on veut identifier ou de la sonde dans l'échantillon. Plus le poids connu est petit, plus le pourcentage devra être élevé.
[modifier] Recettes
Les mélanges ci-dessous ne polymériseront pas tant que le TEMED n'aura pas été ajouté, mais si elle est stockée de façon non polymérisée assez longtemps, le mélange peut ne pas polymériser correctement. La taille standard du gel est de 3x5x0.2 pouces, et en tenant compte des fuites qui se produisent généralement, il faut à peu près 8 ml de solution pour un gel de séparation et 2 ml pour un gel de concentration.
Pour faire 10 ml d'une solution mère à 10% de polyacrylamide (en séparation):
dH20 4,0 ml 30% acrylamide 3,3 ml 1,5M Tris pH8.8 2,5 ml 10% SDS 0,1 ml 10% ammonium persulfate 0,1 ml TEMED 0,004 ml
Pour faire 10 ml d'une solution mère à 5% de polyacrylamide (stacking) (notez que les volumes sont les mêmes qu'au dessus, seule la concentration en Tris varie):
dH20 4,0 ml 30% acrylamide mix 3,3 ml 1,0M Tris pH6.8 2,5 ml 10% SDS 0,1 ml 10% ammonium persulfate 0,1 ml TEMED 0,004 ml
[modifier] Défauts
L'acrylamide est extrémement toxique lorsqu'il est ingéré, et est absorbé très facilement par la peau. Une fois que l'acrylamide est polymérisé, il n'est plus absorbable, mais il faut prendre soin de la façon dont on se débarasse du gel.
