Benutzer:Prof. Dr. A. Barth
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Barth Alfred K. Dr. rer nat. habil. Prof.. Anschrift: Mühlweg 24, 06114 Halle/Saale, Tel./Fax: 0345-4788030, e-mail:rbarth7725@aol.com
Leiter der Abteiung Bioorganische Chemie/Wirkstoffforschung der Universität Halle bis 1992. Forschungsgebiet: Beiträge zum Funktionsmechanismus (Chemismus) der prolinspezifischen Proteasen, speziell der Dipeptidyl Peptidase IV. Entwicklung spezifischer Inhibitoren für dieses Enzym. ca. über 250 Publikationen. Monographien wie z.B.: Peptides and Proteases - Recent Advances (gemeinsam mir R.L. Schowen, USA). Coautor des HAMOG Software Programms.
1978 Comenius Medaille der Universität Bratislava. 1979 Nationalpreis für Wissenschaft und Technik. Deputy Governor of the American Biographical Institute. Member of the International Biographical Centre Cambridge, England. Gold Medal for Germany from the American Biographical Institute.
Biographien publiziert in : Wer ist Wer ? Das Deutsche WHO'S WHO. WHO'S WHO in Germany. WHO'S WHO Namenstexte der Prominenz aus Politik, Wirtschaft und Kultur. Brigitte Schellmann WHO'S WHO in German. Outstanding Europeans of the 21st Century. International Register of Profiles. Great Minds of the 21st Century. European Biographical Directory.
[Bearbeiten] Artikel
Vier Jahrzehnte im Dienste der Wissenschaft, Acta Fakult. Pharm. Univ.Comeniana 52, 236-250 (2005)
[Bearbeiten] Wiki-Artikel
== Der Chemismus der Dipeptidyl Peptidase IV – ein Überblick ==
== [1966 – 2006] ==
Alfred K. Barth
D-06114 Halle/Saale, Mühlweg 24, Bundesrepublik Deutschland
In letzter Zeit häufen sich die Arbeiten über das Enzym Dipeptidyl Peptidase IV. Der Grund ist, dass dieser Biokatalysator interessante regulatorische Funktionen im menschlichen und tierischen Organismus ausübt. Es handelt sich besonders um Publikationen über den Wirkungs- oder Funktionsmechanismus aus physiologisch-biochemischer Sicht. Um so dringlicher ist es, einen Überblick über die Fortschritte des Studiums der Wirkungsweise unter chemischen Aspekten (hier „Chemismus“ genannt) zu geben, und die verstreut publizierten Arbeiten sowie die z. T. noch nicht veröffentlichten Erkenntnisse auf diesem Gebiet in geschlossener Form in einigen wesentlichen Punkten zusammenzufassen.
Der Funktionsmechanismus aus chemischer Sicht (Chemismus)
Um den chemischen Reaktionsverlauf sauber zu studieren, ist die Ermittlung exakter kinetischer Parameter (kcat, KM und kcat/KM) erforderlich. Aus diesem Grunde wurden die Studien (wenn nicht anders vermerkt) mit den Substraten Xaa2-Xaa1-pNitroanilid (pNA) durchgeführt. Infolge der speziellen enzymatischen Hydrolyse der Substrate der Dipeptidyl Peptidase IV ist eine derartige Wahl zulässig. Wenn nicht anders vermerkt, wurden die Untersuchungen mit Dipeptidyl Peptidase IV, isoliert aus Schweinenierenrinde durchgeführt.
Das Enzym Dipeptidyl Peptidase IV (DP IV) wurde 1964/66 von Hopsu-Havu erstmals beschrieben (Hoüsu-Havu und Glenner, Histochem 7, 197; 1966). Es kommt ubiquitär im menschlichen und tierischen Organismus vor. Es ist eine Serinpeptidase, die vom N-terminalen Ende eines Peptids Dipeptide abspaltet, wenn sich bevorzugt Prolinreste in Xaa1- (P1)-Position befinden.
Die Substratspezifität in P1-Position (Xaa1)
Wie gesagt, werden Substrate der DP IV mit relativ hohen Spaltungsraten abgebaut, wenn sich Prolinreste in P1-Position befinden. Es erhebt sich die Frage nach der Substratspezifität in dieser Stellung. Das heißt, welche anderen Aminoacylreste können sich noch in dieser Position befinden ? Zunächst wurde festgestellt, dass neben Prolin- auch Hydroxyprolin- und Dehydroprolinreste sehr gut akzeptiert werden. Auch Substrate mit Pipecolinsäureresten in P1-Stellung sind ähnlich aktiv. Im Schema 1 wird ein „Prolinstammbaum“ vorgestellt, der auf direktem Wege vom Prolin bis zum Glycin führt. Wie verhalten sich nun die einzlnen Dipeptid-pNA, wenn in P1-Stellung Prolin durch die angeführten Aminoacylreste des „Stammbaums“ ausgetauscht wird ? Es konnte gezeigt werden, dass alle diese Derivate mehr oder weniger aktive Substrate darstellen. Erfolgreich geprüft wurden in Ala-Xaa1-pNA besonders Xaa1 = Thz, Oxa, Pip und Aze.
Schema 1 : Prolinstammbaum (In dem Schema ist auch das Sechsringsystem der Pipecolinsäure enthalten, sie liefert auch aktive Substrate).
Ferner wurden geprüft die Xaa1-Reste von: Gly, Abu, Nva, Sar, N-Ethyl-Gly, N-(nPropyl)-Gly, N-Methyl-Abu, N-Methyl-Ala und N-Ethyl-Ala. Interessant ist, dass es im Hinblick auf die Wirksamkeit der DP IV Substrate eine Abstufung in folgender Richtung gibt:
Prolin > Alanin > Glycin.
Hinsichtlich des kcat/KM-Wertes ist das Aze-Derivat vergleichbar mit dem entsprechenden Pro-Substrat. In dem einen Fall handelt es sich um einen Fünf- im anderen Fall um einen Vierring. Ebenfalls interessant war die Prüfung der Verbindungen Als-Xaa1-pNA mit Xaa1 = a-5MeOxa, und s-5MeOxa. Ala-(s-5MeOxa)-pNA fungierte als Substrat, Ala-(a-5MeOxa)-pNA nicht [s = syn, a = anti]. Der Prolinring ist nicht planar gebaut, sondern liegt in einer Konfiguration analog dem Schema 2 (links) vor.
Schema 2
„γ-Puckering“ der fünfgliedrigen Ringe am Beispiel des Thz; für den Oxa-Aminoacylrest ist der Schwefel durch Sauerstoff ersetzt und für Prolin durch >CH2; Stellung der Hydroxylgruppe im Hyp-System {Ala-Hyp-pNA [Ala-trans-Hyp-pNA oder Ala-anti-Hyp-pNA; Ala-cis-Hyp-pNA oder Ala-syn-Hyp-pNA (rechts)}
Demzufolge sind auch die Positionen im Ringsystem des Prolins unterschiedlich zu bewerten. Daraus erklärt sich, warum Xaa2-Hyp-pNA ein Substrat ist, Xaa2-(a-5MeOxa)-pNA aber mittels DP IV nicht enzymatisch hydrolysiert wird.
Es wird beobachtet, dass in Substraten vom Typ Xaa2-Pro-X’aa1 die Spaltungsrate von der Natur des Restes X’aa1 abhängt. Offensichtlich verschiebt sich in diesem Falle der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (siehe unten) von der Deacylierung (k3) in vorangehende Schritte. Denkbar ist eine Behinderung des Einstroms dieser Substrate in das aktive Zentrum der DP IV. Der langsamste Schritt sollte hier möglicherweise vor dem eigentlichen katalytischen Prozess liegen. Hier ist im einfachsten Fall (bei Annahme von ka sehr viel kleiner als k3 und k3 sehr viel kleiner als k2 und k1)
kcat = k3ka und KM = k-ak3/kak1
ka = Geschwindigkeitskonstante des Einstroms des Substrates in das aktive Zentrum k-a = Geschwindigkeitskonstante des Ausstroms des Substrates aus dem aktiven Zentrum k1 = Geschwindigkeitskonstante tetrahedralen Intermediats k2 = Geschwindigkeitskonstante des Acylierungsschrittes (TI1 ® Acylenzym) k3 = Geschwindigkeitskonstante des Deacylierungsschrittes (TI2 ® Dipeptid).
Die Substratspezifität in P2-Position (Xaa2)
Auch wurde die Bedeutung des N-terminalen Aminosäurerestes in P2-Stellung (Xaa2) eruiert. Untersucht wurden u.a. in Xaa2-Pro-pNA die Reste von : Pro, Abu, Leu, Val, Ala, Ile, Glu, Phe, Tyr, Ser, Gln, Lys, Asp, Asn sowie N,N-Dimethyl-Glycin, N,N,N-Trimethyl-Glycin und S,S-Dimethyl-sulfonium-essigsäure. Alle Substanzen fungierten als Substrate der DP IV (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1
Wie weit entfernt kann die N-terminale Aminofunktion von der Peptidbindung zwischen P1 und P2 sein ? Dazu wurden in Xaa2-Pro-pNA Aminosäurereste von Ala, β-Ala, γ-Abu und ε-Ahx verwendet. Die Derivate von Ala, β-Ala und γ-Abu sind Substrate der DP IV mit fallender Tendenz. Die ε-Ahx Verbindung wird nicht hydrolysiert.
Tabelle 2
Die Rolle der Aminoacylreste in P’1-Position (X’aa1)
Um die Bedeutung der Aminoacylreste in P’1-Position zu klären wurden kinetische Studien mit den Tripeptiden Ala-Pro-X’aa1 durchgeführt. Überraschenderweise zeigt sich, dass keine enzymatische Hydrolyse stattfindet, wenn X’aa1 = Pro-, Hyp-, Dehydroprolyl-, Pipecolyl-, Aciridyl-Reste sind oder allgemein die zu spaltende Peptidbindung –CO-NH- durch –CO-N(R)- ersetzt ist (R ¹ H).
Die „Erkennungsstruktur“ der Substrate der DP IV
Auf Grund des umfangreichen kinetischen Datenmaterials wurden intensive Studien der Computersimulation durchgeführt. Ein Resultat dieser Bemühungen war die Formulierung einer Struktur, die alle Substrate besitzen müssen, um im aktiven Zentrum der DP IV als Substrate erkannt zu werden. Diese „Erkennungsstruktur“ ist in der Abbildung 1 gezeigt.
Abb. 1
Von Bedeutung ist die interne H-Brücke. Jede Behinderung ihrer Ausbildung führt zur Inaktivität als Substrat. Die Tatsache, dass jede Substitution an der NH-Gruppe der zu spaltenden Peptidbindung diese verhindert ist der Grund, warum alle Peptide die das Strukturmerkmal –CO-N(R)- mit R ungleich H haben einer enzymatischen Hydrolyse nicht zugänglich sind. Es ist zu erwarten dass die interne H-Brücke verhindert wird durch:
a) eine cis-Peptidbindung und b) den optischen Antipoden
Es ist bekannt, dass Prolinpeptide über eine messbare cis-Konfiguration an der Peptidbindung verfügen. Wir haben das Verhältnis von trans- zu cis-Bindung am Beispiel des Substrates Ala-Pro-pNA ermittelt und die enzymatische Hydrolyse mit Hilfe der schnellen Kinetik (stopped flow Messungen) verfolgt. Es zeigt sich ein biphasischer Umsatzes nach der Zeit. In der ersten Phase kann ein schneller von der Enzymkonzentration abhängiger Abbau bis zu dem Prozentsatz, der für das Vorhandensein der trans-Peptidbindung gefunden wurde, beobachtet werden, danach erfolgt ein langsamer Reaktionsverlauf, der bestimmt wird, von der enzym-unabhängigen cis-trans-Umwandlungsgeschwindigkeit. Demnach erfolgt erwartungsgemäß eine Spaltung nur über die trans-Bindung, die cis-Bindung ist inaktiv.
Die Stereospezifität
Ferner sind die Substrate in P1-Position absolut stereospezifisch. Ala-L-Pro-pNA z.B. ist ein gutes Substrat, Ala-D-Pro-pNA wird enzymatisch nicht hydrolysiert. Bei Verbindungen vom Typ D-Xaa2-Pro-pNA findet ebenfalls keine Hydrolyse statt. D-Xaa2-Ala-pNA aber sind Substrate der DP IV. Tabelle 3 demonstriert dies am Beispiel des Ala-Ala-pNA, D-Ala-Ala.pNA und Aib-Ala-pNA. Das Phänomen, dass D-Phe-Pro-pNA und D-Tyr-Pro-pNA unkompetitive Inhibitoren der Hydrolyse von Ala-Pro-pNA sind (die Ki-Werte sind: 0,35 ± 0,04 mM und 0,52 ± 0,04 mM), wonach beide Inhibitoren keine kompetitive oder gemischte Hemmer sind, und bei Ala-Ala-pNA als Substrat die Verbindungen keinen inhibitorischen Effekt zeigen, ist im Zusammenhang mit den in dieser Arbeit diskutierten theoretischen Schlussfolgerungen zu sehen.
Tabelle 3
Auffallend ist, dass die Stereoselektivität in P2, wie die Tabelle 3 zeigt, sich nicht auf den KM-Wert, wohl aber gravierend auf die kcat-Werte aufwirkt. Auf diesen Effekt, der überraschend ist, soll weiter unten eingegangen werden.
Die Sequenz der Enzymkatalyse
Es wird angenommen, dass im Verlaufe der Enzymkatalyse die Reaktionsfolge, dargestellt in Schena 3, durchlaufen wird :
Schema 3
Danach ist zwischen einem Acylierungsprozess und einem Deacylierungprozess zu unterscheiden. Das Substrat dringt in das aktive Zentrum ein (siehe Erkennungskomplex) und es bildet sich ES. Daraus folgt das tetrahedrale Intermediat des Acylierungsprozesses TI1. Nach Abspaltung des ersten Spaltproduktes entsteht durch Anlagerung eines Wassermoleküls das zweite tetrahedrale Intermediat TI2 (Deacylierungsprozess). Nach Spaltung von diesen wird letztendlich das freie Enzym und das zweite Spaltprodukt (Dipeptid) freigesetzt. Das erste tetrahedrale Intermediat TI1 ist asymmetrisch. Theoretisch kann sich hier eine S- und/oder eine R-Form ausbilden. TI2 ist dagegen symmetrich. Hier entstehen theoretisch keine antipodischen Strukturen.
Zunächst erhebt sich die Frage, wo bei den Substraten der geschwindigkeitsbestinnende Schritt lokalisiert ist, ob im Bereich der Acylierung oder der Deacylierung. Es wurden daher Untersuchungen mit den Substraten Ala-Ala-anilid und Ala-Pro-Anilid mit verschieden substituierten Arylringen im pH-Optimum durchgeführt. Der Hansch-Approach (QSWA = Quantitative-Struktur-Wirkungs-Analyse) brachte keine Korrelaton bei den substituierten Derivate der Reihe Ala-Pro-Anilid, wohl aber eine solche in der Reihe Ala-Ala-Anilid.
Substrat : Ala-Ala-NH-C6H4-R
QSWA : lgkcat = 0,807s + = 0,186
R : -H, p-F, p-Cl, p-Br, p-CH3, p-OCH3, p-OC2H5, p-NO2, m-Cl
m-CH3, m-CF3, m-NO2
Substrat : Ala-Pro-NH-C6H4-R
QSWA : keine Korrelation
Daraus geht hervor, dass der geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Alanireihe in der Acylierung liegt, in einem Bereich also, wo die substituierten Aniline noch nicht abgespalten sind (k2). In der Prolinreihe dagegen sollte der geschwindigkeits- bestimmende Schritt in der Deacylierung liegen (k3). Die Messungen wurden beim pH-Optimum (siehe unten) durchgeführt.
Die Frage ist nun : lässt sich die Konformation des tetrahedralen Intermediats TI1 ermitteln ? Zu diesem Zwecke wurde eine QCAR Analyse (Quantitative Conformation Activity Relationships) in der Alaninreihe durchgeführt. Die Resultate lassen vermuten, dass die Effekte dann auftreten, wenn der –NH-Ar-Rest aus dem tetrahedralen Intermediat TI1 austritt (k2). Aus der QCAR-Analyse folgt nämlich eine mögliche Konformation bei der eine „Behinderung“ der Wasserstoffatome a und b, die, entsprechend der Struktur in Schema 4 bei der Rotation des aromatischen Ringes auftritt.
Schema 4
Das Schema 5 demonstriert die beiden Antipoden des TI1. Nur die Form links führt zur sterischen Hinderung der oben genannten Wasserstoffatome, nicht aber die rechts dargestellte Struktur. Dies könnte ein Hinweis auf die Stereospezifität des tetrahedralen Intermediates TI1 sein (im Zusammenhang mit den Ergebnissen der D-Isotopemessungen – siehe unten).
Die Untersuchungen zur pH-Wert Abhängigkeit, demonstriert an der DP IV aus Schweinenierenrinde, ergab ein pH-Optimum von ca. 6,7. Das Temperaturoptimun liegt bei etwa 30 Grad C. Die Studien ergaben ferner, dass für die Aktivität der Substrate eine positive Ladung am N-Terminus nötig ist. Dabei ist die Protonisierung der N-terminalen primären Aminogruppe notwendig. Sie ist aber keine Bedingung. Für die Substraterekennung ist die Existenz einer positiven Ladung genügend, wie aus der Tabelle 1 hervorgeht. Streng genommen handelt es sich bei der DP IV also nicht um eine Aminopeptidase, sondern um eine Oniumacylaminoacyl Peptidase. Die katalytische Abspaltung von Dipeptiden aus einem Oligo- oder Polypeptid vom N-terminalen Ende ist aber, physiologisch gesehen, ein essentieller Prozess. Dennoch sollte die Bezeichnung DAP IV nach Möglichkeit zugunsten der Kennzeichnung DPP IV, besser DP IV, vermieden werden.
Schema 5
Sekundäre D-Isotopieeffekte und Solventisotopieeffekte in D2O
Im Schema 4 und Schema 5 (links) ist ein mögliches Modell des TI1 dargestellt. Seine Bestätigung sollte durch D-Isotopieeffekte möglich sein, wenn einerseits ein H/D-Austausch im Asymmetriezentrum der P1 Aminosäure erfolgt und andererseits ein H/D-Austausch im aromatischen Ring in o-Stellung erfolgt. Es zeigt sich, dass in beiden Fällen sekundäre D-Isotopieeffekte zu messen sind. Bei Ala-Ala-pNA (L-Ala-L-Ala-d1-pNA) sind im pH-Optimum bei Zimmertemperatur sekundäre D-Isotopieeffekte messbar. Sie betragen in kcat = 1,27 und in KM = 1,24. Wird das Substrat im aromatischen Ring vollständig deuteriert (Ala-Ala-NH-C6D4-pNO2), so ergeben sich sekundäre D-Isotopieeffekte in kcat und in KM von 1,05 ± 0,03. Interessant ist, dass ein sekundärer D-Isotopieeffekt in kcat/KM, entsprechend dem Schema 6 in Abhängigkeit vom pH-Wert auftritt. Der Kurvenverlauf ist bemerkenswert. Bei fallenden pH-Werten von etwa 7,5 bis etwa 5,0 ist kein Isotopieeffekt messbar. Ab pH 5.0 beobachtet man einen steigenden sekundären D-Isotopieeffekt mit fallendem pH-Wert, verbunden mit einem Übergang von k3 nach k2 als geschwindigkeitsbestimmenden Schritt.
Schema 6
Dieses Resultat unterstreicht die hohe Wahrscheinlichkeit der in dem Schema 4 dargestellten Struktur.
Messungen der Solvent-D-Isotopieeffekt ergeben im Falle der Substrate Ala-Pro-pNA und Gly-Pro-pNA mit dem in der Deacylierung liegenden geschwindigkeitbestimmen- den Schritt einen Ein-Protonen-Übergang und beim Ala-Ala-pNA, der geschwindigkeits bestimmende Schritt in der Acylierung liegend, einen Zwei-Protonen-Übergang (Tabelle 4).
Tabelle 4
Inhibitoren
Es wurden eine Reihe von Dipeptiden auf ihre Wirkung als (kompetitive) Inhibitoren der DP IV untersucht. Die Tabelle 5 zeigt eine Übersicht.
Tabelle 5
Von diesen Dipeptiden, die auch Spaltprodukte DP IV-Katalyse sind, ist das Ile-Pro mit einem Ki-Wert von etwa 7,0 x 10-6 [M] und das ε-Z(4-NO2)Lys-Pro (Ki etwa 10-6) interessant. Um etwa eine Größenordnung wirksamer sind die entsprechenden Pyrolidide (Tabelle 6)
Tabelle 6
Röntgenkristallstruktur der Dipeptidyl Peptidase IV
Gegenwärtig sind intensive Studien auf den Gebiet der Röntgenkristallstrukturanalyse der DP IV im Gange. Das Enzym besteht in der Regel aus zwei identischen Untereinheiten. Jede dieser Untereinheiten besitzt eine N-terminale Peptidsequenz, die das Protein an der Oberfläche einer Zelle verankert. Es wurden auch höhere Aggregate bei der löslichen DP IV gefunden, bestehend aus vier identischen Untereinheiten.
Für bestimmte Aussagen ist eine nicht so in das Detail gehende Darstellung der Conolli-Oberfläche günstiger. Hier zeigt sich, dass die DP IV eine ungewöhnliche Oberflächenstruktur besitzt. Das aktive Zentrum befindet sich nicht an der Oberfläche außen, sondern in Innern des Proteins. Der Zugang zu dem aktiven Zentrum ist durch einen „Schlauch“ möglich, der eine größere und eine kleinere Öffnung besitzt. Die Frage ist, wie und vor allem wo erfolgt z.B. der Substrateintritt ? Die Abbildung 2 zeigt diese Struktur, wie sie von der Gruppe um Reutter veröffentlicht wurde
Abb. 3
Wenn man sich das elektrostatische Potential an der Oberfläche ansieht, so stellt man fest, dass in der Nähe und innerhalb der großen Öffnung ein sehr starkes negatives Potential mit einem Gradienten in Richtung der Öffnung vorhanden ist. Die kleinere Öffnung hat demgegenüber kein so starkes negatives Potential (Abbildung 3). Es ist daher denkbar, dass die Substrate mit dem positiv geladenen N-Terminus der das Potential größerer Bereiche der Erkennungsstruktur der Substrate prägt in diese Öffnung „hineingezogen“ werden. (Darstellung einer Untereinheit, humane DP IV).
Abb. 3
Die Struktur des tetrahedralen Intermediats TI1
Aus dem experimentellen Befund, wonach das als Substrat fungierende D-Ala-Ala-pNA über kcat wirkt, wobei KM gegenüber dem des Substrates Ala-Ala-pNA unbeeinflusst bleibt (siehe Tabelle 3), drängt sich die Deutung auf, dass der N-terminale Aminoacylrest (wahrscheinlich mit der positiven Ladung) direkt mit dem tetrahedralen Intermediat in P1-Position in Wechselwirkung tritt. Daher wurde eine hypothetische Konformation wie folgt konstruiert (Schema 7).
Schema 7
Der Unterschied zwischen den Substraten die Prolin- und der Alaninreihe besteht darin, dass die Bindung A-B etwas drehbar ist. Die damit verbundenen Reste können sich im begrenzten Maße an räumliche Bedingungen des Enzymproteins anpassen. Im ersteren Fall ist diese Bindung nicht flexibel.
Es scheint zwei Typen von Wasserstoffbrücken zu geben, nämlich solchen, die für die direkte Bindung im aktiven Zentrum verantwortlich sind, d.h. das Substrat oder den Inhibitor an die wechselwirkungsaktiven Reste des Proteins heranführen und solchen, die direkter Bestandteil des Funktionsmechanismus sind.Wenn im Laufe des Funktionsmechanismus der Serinproteasen tetrahedrale Intermediate TI1 und TI2 (siehe Schema 3) entstehen, ist TI1 asymmetrisch. Beim Aufrichten des Carbonylatoms der zu spaltenden Peptidbindung können sich zwei antipodische Konformationen ausbilden, von der eine das Peptid als Substrat (1), die andere als Inhibitor (2) erkennen sollte (Schema 5) Die Entscheidung, in welcher Richtung sich die Carbonylgruppe aufrichtet, d.h. welches der antipodischen tetrahedralen Intermediate bevorzugt entsteht, wird davon abhängen, in welcher Richtung die Wechselwirkungen der Proteinseitenketten im aktiven Zentrum (z.B. H-Brücken) am wirkungsvollsten sind bzw. die räumliche Anpassung des Effektormoleküls am effektivsten erfolgt. So ist es durchaus möglich, dass ein Inhibitormolekül auch Substrat sein kann. Eine entscheidende Triebkraft der Abtrennung eines Molekülteils aus dem tetrahedralen Intermediat ist, ob das Prinzip der stereoelektronischen Kontrolle nach Delonghchamps gültig ist. Es besagt, dass die Spaltung von Estern oder Amiden über ein tetrahedrales Intermediat nur erfolgen kann, wenn beide am zentralen sp3-Kohlenstoffatom verbleibende Heteroatome eines ihrer einsamen Elektronenpaare jeweils antiperiplanar zur spaltenden Bindung ausrichten.
Die Röntgenstrukturanalyse des DP IV/Pro-Pro-boronsäurekomplexes bestätigt in eindrucksvoller Weise die im Schema 7 angenommene Struktur (Abbildung 4). Von Interesse ist, dass der Boronsäurekomplex tatsächlich eine tetrahedrale Struktur ausbildet, dass eine Wechselwirkung einerseits mit dem Tyr547 des Proteins und einem O-Atom des TI (Abstand = 2,04 A) stattfindet und dass andererseits zwischen dem Asn710 des Proteins und dem Sauerstoffatom der Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung eine Wechselwirkung erfolgt (Abstand = 1,93 A). Letztere H-Brücke ist sinnvoll. Sie fördert die Aufrichtung der Carbonylgruppe der N-terminalen Peptidbindung im oben gezeigten Sinne (vergl. Schema 7). Diese Verhältnisse sind in dem Ausschnitt aus der Röntgenkristallstruktur des DP IV/boronsäure-Komplexes (Abbildung 9) ersichtlich.
Abb. 4
Ähnliche Bilder zeigen die durch Diprotin A (Abbildung 5 – rechts) und tertBuGly-Pro-Ile (Abbildung 5 – links) erzeugten Strukturen. Hier entstehen asymmetrische tetrahedrale Konformationen. Sie stellen sich als antipodisch gegenüber der in dem Schema 7 bzw. der Abbildung 8 angenommenen Struktur dar. Sollten diese durch die Röntgenstruktur ermittelten realen antipodischen Strukturen charakteristisch für Transition-State-Inhibitoren sein ? Durch diese hypothetische Annahme ließe sich erklären, warum die Verbindungen
Diprotin A (Ile-Pro-Ile)
Diprotin B (Val-Pro-Leu) und
TertBuGly-Pro-Ile,
die grundsätzlich eine Substratstruktur besitzen, Inhibitoren sind. Der Begriff „hypothetisch“ bringt zum Ausdruck, dass die hier gezeigten Röntgenstrukturen (Abbildung 5) die Konformationen von Inhibitoren darstellen, die Konformationen der TI (TI1) von Substraten können unter den experimentellen Bedingungen der Röntgenkristallstruktruranalyse nicht dargestellt werden.
Abb. 5
Die Frage: Sind Diprotin A oder Diprotin B Substrate oder Inhibitoren der DP IV ? – wurde im Jahre 1991 von Rahfeld et al. gestellt. Umezawa et al. berichten, dass beide Diprotine als Inhibitoren der DP IV wirken. Rahfeld stelle fest, dass sowohl Ile-Pro-Ile als auch Val-Pro-Leu erwartungsgemäß Substrate der DP IV sind. Die Autoren sprechen von der Inhibitorwirkung als einem „kinetischen Artifakt“ Die Röntgenkristallstruktur-Studien belegen die Konformation in TI1, die dem Inhibitormolekül zugeordnet werden sollte, denn die Substratstruktur ist mit Sicherheit unter den Kristallisationsbedingungen nicht erfassbar. Um so erstaunlicher ist, dass die Diprotine im wässriger Milieu (kinetische Messungen) nach längerer Zeit (nach ca. 20,5 Stunden unter den in der Literatur angegebenen Bedingungen) vollständig hydrolysiert werden. Offensichtlich stellt sich ein Gleichgewicht der antipodischen TI-Konformationen in verdünnter wässriger Lösung allmählich immer wieder neu ein. Über einen solchen Mechanismus wird der Dualismus bei den Diprotinen klar. Ihre Ki- und KM-Werte sind in der Tabelle 7 gezeigt.
Tabelle 7
Natürliche Substrate der Dipeptidyl Peptidase IV (eine Auswahl)
Wie bereits gesagt, baut die Exopeptidase Dipeptidyl Peptidase IV Peptide vom N-terminalen Ende ab, wenn sich in P1-Position bevorzugt Prolin-, Hydroxyprolin- oder Alaninreste befinden. Dabei kommt es entweder zu einem vollständigen oder limitierten Abbau, wobei entweder Modulationen der Wirksamkeit oder Freisetzungen von aktiven Wirkstoffen bzw. Effektoren resultieren können. Auch gibt es Peptidstrukturen, die trotz eines potentiell reaktiven N-Terminus Xaa-Pro- bzw. Xaa-Ala- nicht abbaubar sind. Für jeden dieser Fälle sei ein Beispiel wie folgt angeführt.
β-Casomorphine sind opiatartige Peptide, die aus dem β-Casein der Kuhmilch isoliert wurden. Die aktivste Verbindung ist das β-Casomorphin-5, ein Pentapeptid mit folgender Stuktur: Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly. Es wird durch DP IV entrsprechend der angegebenen Reaktionsfolge abgebaut
Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly
Phe-Pro-Gly
Gly
Die Substanz P hat folgende Struktur: Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2. Sie wird durch DP IV limitierend hydrolysiert. Dabei kommt es zu einer messbaren Aktivitätserhöhung.
Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2
Sehr interessant sind die Arbeiten der Gruppe um Kreil aus Salzurg (Oestrreich), das aktive Gift der Honigbiene betreffend. Aus einem Vorläuferpeptid (Promelittin) wird durch Dipeptidyl Peptidase IV aus der Giftdrüse der Honigbiene das Bienengift Melittin freigesetzt, indem Schritt für Schritt 10 Dipeptide der Sequenz Xaa-Pro und Xaa-Ala abgespalten werden.
Promelittin :
Ala-Pro-Glu-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Glu-Pro-
Glu-Ala-Asp-Ala-Glu-Ala-Asp-Pro-Glu-Ala-Gly-Ile-Gly-Ala-
Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-
Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-
Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly
Melittin :
Gly-Ile-Gly-Ala-
Val-Leu-Lys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-
Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-
Ser-Trp-Ile-Lys-Arg-Lys-Arg-Gln-Gln-Gly
Bradykinin ist trotz der N-terminalen Sequenz Arg-Pro- durch DP IV nicht hysrolysierbar, da in P’1-Position Pro steht (Arg-Pro-Pro-....).
Bradykinin :
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg = (keine Spaltung)
Zusammenfassung
Die aufgrund der experimentellen Ergebnisse getroffenen theoretischen Ableitungen beantworten unter anderem folgende Fragen :
1. Warum ist bei den Substraten der DP IV ein positiver N-Terminus insbesondere z.B. eine protonisierte N-terminale Aminogruppe nötig. Warum sind
N,N,N-Trimethylammoniumacetyl-Pro-pNA, Pyridimiumacetyl-Pro-pNA oder
S,S-Dimethylsulfoniumacetyl-Pro-pNA Substrate der DP IV ?
2. Warum werden Peptide enzymatisch nicht hydrolysiert, wenn sich in P’1-Position z.B. ein Prolylrest befindet, bzw. allgemein die entsprechende Peptidbindung zwischen der P1- und P’1-Position die Struktur –CO-N(R)- hat (R ungleich H) ?
3. Warum sind alle Peptide, die in P1-Position einen Aminoacylrest enthalten der sich vom „Prolinstammbaum“ ableitet, mehr oder weniger Substrate der DP IV ?
4. Warum werden bei der enzymatischen Hydrolyse durch DP IV von einem als Substrat funktionsfähigen Peptid spezifisch Dipeptide abgespalten ?
5. Warum ist z.B. D-Ala-Ala-pNA ein Substrat der DP IV, D-Ala-Pro-pNA aber nicht ?
6. Warum ist z.B. Ala-(syn-5MeOxa)-pNA ein Substrat der DP IV, Ala-(anti-5MeOxa)-pNA nicht und warum ist Xaa-Hyp-pNA ein Substrat und Xaa-(anti-5MeOxa)-pNA keines ?
7. Warum ist in spaltfähigen Tripeptiden (freier C-Terminus) der „Prolinreihe“ der geschwindigkeitsbestimmende Schritt von der Natur des C-terminalen Aminoacylrestes abhängig ?
8. Warum inhibiert unter Standardbedingungen PMSF die Serinprotease DP IV nicht ?
9. Warum sind Aminoacyl-Pyrolidide, -Oxazolidide oder –Thiazolidide bessere Inhibitoren der DP IV als die entsprechenden Xaa-Pro, Xaa-Oxa oder XaaThz Dipeptide ?
10. Warum sind z.B. Boronsäuren Tranition-State-Inhibitoren der Serinproteasen(DP IV) ?
11. Wie erklärt sich der „Dualismus“ Substrat/Inhibitor z.B. bei den Diprotinen ?
Abschließende Bemerkungen
Die Dipeptidyl Peptidase IV ist physiologisch und pharmakologisch von großem Interesse. Einige aktive und spezifische Inhibitoren des Enzyms wurden als potentielle Wirkstoffe gegen Diabetes Typ II erkannt. Es gibt berechtigte Vermutungen, dass DP IV oder verwandte Enzyme eine Rolle bei Prozessen der Wundheilung, in der Pathogenese von AIDS und möglicherweise in einer Reihe von Krebsarten spielen. Intensive immunologische Studien sind gegenwärtig im Gange.
Schon vor einigen Jahren wurde die enge Verwandtschaft der Enzyme DP II, um das sich vor allem frühzeitig Ken McDonald aus Charleston (USA) verdient gemacht hat, und PSE (Prolin spezifische Endopeptidase), auch PPCE = Post Proline Cleaving Enzyme genannt, zur DP IV beschrieben, In neuerer Zeit wurde gefunden, dass die DP IV Mitglied einer Familie von Dipeptidyl Peptidasen ist. Es ist zu vermuten, dass auf diesem Gebiet durch vergleichende mechanistische und physiologische Studien noch weitere hochinteressante Einsichten in theoretische und angewandte Fragestellungen resultieren werden.
Ein großer Teil der Arbeiten zum „Chemismus“ der Dipeptidyl Peptidase IV wurden in den letzten 30 bis 40 Jahren in der Forschungsgruppe des Bereiches Biochemie der Universität Halle durchgeführt. Allen fleißigen, engagierten und kreativen Mitarbeitern sei gedankt. Stellvertretend für viele seien genannt; K. Neubert, G. Fischer, J. Heins, H.-U. Demuth, H. Schulz, I. Thondorf, B. Hartrodt, W. Brandt, N. Schutkowski, M. Kaiser, G. Küllerts, J. Rahfeld, H. Mager, B. Wolf u.v.a.
Besondere Kooperationen und intensive fruchtbare Gedankenaustausche zum Thema DP IV fanden vor allem mit folgenden Kollegen statt: R.L. Schowen und F. Leibach (USA), J. Kenny (England), H. Zuber (Schweiz), F. Nyberg (Schweden), T. Yoshimoto und M. Harada (Japan), E. Heymann, R. Mentlein, J. K. Seydel, H.- D. Flad, S. Ansorge, S. Hoffmann, P., W. Reutter, Oehme und R. Franke (Deutschland), Z. Lojda (Tschechien), P. Kovacs, M. Psenak und J. Stano (Slowakei).
Allen sei gedankt !
Insbesondere den Herren Dr. Henning Thielemann und Caspar Forner danke ich für ihre Mitarbeit bei der Gestaltung der INTERNET-Präsentation.
Literaturübersicht (Auswahl)
A.Barth:„Vier Jahrzehnte im Dienste der Wissenschaft“; Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae 52, 236-250 (2005)
G.Küllertz,P.Oehme,A.Barth(Hrsg.):“Dipeptidyl Peptidase IV – Chemie, Biochemie und physiologische Aspekte“ Beitr. Wirkst.forsch. 1981
A.Barth,I.Thondorf,J.Stano:“Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen,Teil I – Die Funktion der Tetrade: Asp.....His....Ser....Xaa“ Acta Fakult. Pharm. Univ. Comenianae 51, 15-26 (2004)
A.Barth, I. Thondorf, S. Gebauer, W. Brandt, K. Neubert, J. Stano, M. Psenak, P.Kovacs : „Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil II–Dipeptidyl Peptidase IV (DP IV/CD 26)“ Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae 52, 7-21 (2005)
A. Barth, I. Thondorf, S. Gebauer, K. Neubert, P. Kovacs, J. Stano : „Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil III – a) Das tetrahedrale Intermediat im Acylierungsprozess. b) Die Boronsäuren“ Acta Facult. Pharm. Univ. Comemianae im Druck
A. Barth, I. Thondorf, K. Neubert, S. Hoffmann, P. Kovacs, J. Stano : „Gedanken zum Mechanismus der Serinproteasen, Teil IV – Trasition State Inhibitoren – Das asymmetrische tetrahedrale Intermediat TI 1 Acta Facult. Pharm. Univ. Comenianae im Druck
W. Brandt, T. Lehmann, T. Hofmann, R.L. Schowen, A. Barth : „The probable Conformation of substrates recognized by dipeptidyl peptidase IV and Some aspects of the catalytic mechanism derived from theoretical investigations” J. Computer-Aided Molecular Design 6, 159-174 (1992)
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A. Barth, K. Neubert, G. Schwarz, G. Fischer, S. Dove, R. Franke : „Enzymatic Hydrolysis of Alanyl-Álanine-Anilides by Dipeptidyl Peptidase IV : A Contribution of QSAR to the Investigation of the Mechanism in QSAR and Strategies in the Design of Bioactive Compounds (Ed. J.K.Seydel) Verlag Chemie Weinheim 1985 , 318-323
W. Brandt, T. Hofmann : „The Recognition Conformation of Substances of the Dipeptidyl Peptidase IV” Biol. Zentr.bl. 107, 21-30 (1988)
G. Küllertz, G. Fischer, A, Barth : „Beiträge zum Katalysemechanismus der Dipeptidyl Peptidase IV” Acta biol. med. germ. 37, 559-567 (1978)
K. Ludwig, Y. Shuling, H. Fan, W. Reutter, Ch. Böttcher : “The 3D structure of DPP IV/ CD 26 as obtained by cryo-TEM and single partiale Analysis Biochem. Biophys. Res. Commun. 304, 73-77 (2003)
M. Engel, T. Hofmann, S. Manhart, U. Heiser, S. Chambre, R. Huber, H.-U. Demuth, W: Bode : „Rigitity and Flexibility of Dipeptidyl Peptidase IV: Crystal Structures of and Docking Experiments with DP IV” J. Mol. Biol. 355, 768-783 (2006)
R. Thoma, B. Löffler, M. Stihle, M. Huber, W. Ruff, A. & M. Hennig :“Structural basis of proline-specific exopeptidase activity as observed in Human dipeptidyl peptidase-IV Structure (Camb), 11, 947-959 (2003)
J. Rahleld, M. Schierhorn, B. Hartrodt, K. Neubert, J. Heins : „Are diprotin A (Ile-Pro-Ile) and diprotin B (Val-Pro-Leu) inhibitors or substrates of dipeptidyl peptidase IV? Biochim. Biophys. Acta 1076, 314-316 (1991)
H. Umezawa, T. Aoyagi, K. Ogawa, H. Naganawa, M. Hamada, T. Takeuchi : “Diprotins A and B, Inhibitors of Dipeptidyl Aminopeptidase IV, Produced by Bacteria J. Antibiotics 37, 422-425 (1984):
