Primer Extension
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Die Primer Extension [ˊpʁaɪ̯mɐ][ɪkˊstenʃn] ist eine molekularbiologische Methode, die im Allgemeinen dem Nachweis des "vorderen" Endes von einem Gen dient. Dazu werden aus einen Gemisch von RNA-Molekülen die 5'-Enden einer bestimmten RNA-Molekülsorte (auch RNA species genannt) ermittelt. Ein 5'-Ende ist zumeist auch ein Transkriptionsstartpunkt des betrachteten Gens.
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[Bearbeiten] Beschreibung der Methode
Beim Primer Extension wird ein kurzes, (zumeist) synthetisch hergestelltes Stück DNA - der sogenannte Primer - an zuvor isolierte RNA angelagert. Dazu werden die RNA und die Primer-Moleküle zusammengegeben und erhitzt. Durch das Erhitzen trennen sich doppelsträngige Bereiche zwischen RNA und RNA (aber auch zwischen RNA/DNA und DNA/DNA). Nachfolgend wird der Ansatz wieder abgekühlt, wodurch sich die Primer-Moleküle an die RNA anlagern können. Auf Grund ihrer "Buchstabenfolge" lagern sich die Primer-Moleküle an die dazu vorgesehene "Buchstabenfolge" (=Nukleinsäure-Sequenz) der RNA an. Dadurch finden die Primer-Moleküle im Gemisch "ihr" Gen.
Das System enthält im Wesentlichen noch zwei weitere Komponenten. Das sind die Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs, kurz ATP, CTP, GTP und TTP), die als "einzelne Buchstaben" fungieren und ein Enzym, das als Reverse Transkriptase bezeichnet wird. Die Reverse Transkriptase bindet am DNA/RNA-Hybrid-Molekül und füllt den Primer - in Bezug auf die Gen- bzw. mRNA-Richtung - von "hinten nach vorne" mit Nukleotiden auf. Dabei dient die mRNA des betrachteten Gens als Matrize. Durch die Verlängerung (Extension) wird der Primer zur cDNA. Die cDNA kann nach Trennung von der RNA (z. B. durch alkalische Lyse und/oder RNA-abbauende Enzyme) einer weiterführenden Analyse unterzogen werden.
Im Allgemeinen läuft die weiterführende Analyse so, dass der cDNA aus dem Primer-Extension-Ansatz ein Sequenzierungs-Ansatz bereits bekannter chromosomaler DNA gegenüber gestellt wird. Das bekannte, zumeist klonierte Stück DNA beinhaltet den Primer-Bereich und sollte an der "anderen" Seite über das noch nicht genau kartierte "vordere" Ende des betreffenden Gens hinausreichen. Die Sequenzier-Reaktionen werden mit dem gleichen Primer durchgeführt wie die cDNA-Synthese. Die Primer-Extension-Produkte und die Reaktionen der DNA-Sequenzierung werden auf ein sogenanntes "Sequenziergel" aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen. Anhand des Vergleiches der DNA-Fragmentlängen kann der Transkriptionsstartpunkt ermittelt werden.
[Bearbeiten] Entstehung
Das Primer Extension wurde in den späten 1970ern entwickelt. Dabei wurden im Wesentlichen zwei Richtungen verfolgt und zusammengeführt: die DNA-Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch (Sanger und Coulson, 1975; Sanger et al., 1977) und die cDNA-Synthese durch Reverse Transkriptasen (Thompson et al., 1979; Qu et al. 1983). Während "... primer extension ..." anfangs eher als Wortgruppe denn als Name einer Methode eingesetzt wurde, setzte sich der Begriff anfang der 1980er als terminus technicus durch und bezeichnet zumeist die oben beschriebene Variante. Methoden, bei denen die Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch direkt an die cDNA-Synthese gekoppelt sind, werden heute eher als "direkte RNA-Sequenzierung" bezeichnet.
[Bearbeiten] Homonyme und Synonyme
Homonyme: Neben einigen von Primer Extension verschiedenen molekulargenetischen Methoden, bei denen ebenfalls die Verlängerung eines Oligonukleotides durch Nukleinsäurepolymerasen eine Rolle spielt, wird die Wortgruppe "...primer extension..." vor allem bei der Beschreibung der DNA-Replikation eingesetzt.
Synonyme: cDNA extension by reverse transcriptase; reverse transcriptase mapping; RT-mapping; RT-Kartierung;
[Bearbeiten] Quellen
(PMID = PubMed-Identifizierungsnummer)
- Qu, H. L., Michot, B., Bachellerie, J. P. (1981). Improved methods for structure probing in large RNAs: a rapid 'heterologous' sequencing approach is coupled to the direct mapping of nuclease accessible sites. Application to the 5' terminal domain of eukaryotic 28S rRNA.
Nucl Acids Res 11:5903-5920 PMID 6193488
- Sanger, F., Coulson, A. R. (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol 94:441-44 PMID 1100841
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467 PMID 271968
- Thompson, J. A., Radonovich, M. F., Salzman, N. P. (1979). Characterization of the 5'-terminal structure of simian virus 40 early mRNA's. J Virol 31:437-446 PMID 90173
