Northern Blot

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Der Northern Blot ist eine molekularbiologische Methode zur Übertragung (Blotten) der in der Gelelektrophorese aufgetrennten RNA auf eine Membran (Diazobenzyloxymethyl-(DBM)-Papier oder unter bestimmten Bedingungen Nitrocellulose oder Nylon). Auf der Membran ist die spezifische Markierung von RNA-Sequenzen durch die Hybridisierung mit komplementären Gensonden möglich.

[Bearbeiten] Anwendung

Die Methode des Northern Blotting wird zum Beispiel verwendet um die für ein Protein kodierende mRNA eines Mutanten Organismus mit der eines "normalen" Organismus zu vergleichen. Ein entsprechender Versuch könnte folgendermaßen aussehen:

Um eine Mutante eines Organismus zu untersuchen, sprich das für das fehlende oder nicht funktionale Protein kodierende Gen zu untersuchen, bedient man sich einer Methode die Northern Blotting genannt wird. Hierzu nimmt man das passende Gewebe, in dem das Protein vorkommt, bzw. vorkommen müsste, sowohl vom Mutanten, als auch vom normalen Individuum (als Kontrolle) und schließt die Zellen in einer starken Detergenzlösung auf, die die Nucleasen inaktiviert, damit diese die Nukleinsäuren nicht angreifen können. Nachdem die überflüssigen Proteine komplett denaturiert wurden und durch wiederholte Phenolextraktionen entfernt wurden und kleinere Moleküle durch Fällung in Alkohol entfernt wurden, werden RNA und DNA durch ihre unterschiedlichen Löslichkeiten in Alkohol voneinander getrennt. Verunreinigungen werden durch hochspezifische Enzyme, DNase, abgebaut. mRNAs werden durch Zurückhalten an einer chromatographischen Säule, die spezifisch die Poly(A)-Schwänze der mRNAs bindet, entfernt. Jetzt werden zunächst die intakten und gereinigten mRNA-Moleküle aus mutierten und aus normalem Gewebe durch Gelelektrophorese getrennt. Damit die RNA-Moleküle für DNA-Sonden zugänglich werden, überträgt (blottet) man das Bandenmuster der fraktionierten mRNA auf ein Blatt Nitrocellulosepapier und kopiert sie auf diese Weise. Diese Membran inkubiert man in einer Lösung die eine markierte DNA-Sonde enthält, deren Sequenz einem Abschnitt des Protein-Gens bzw. der mRNA entspricht. Die RNA-Moleküle, die auf der Membran mit der markierten Sonde hybridisieren, werden nun autoradiographisch oder chemisch nachgewiesen. Die Größe der RNA-Moleküle in jeder Bande kann durch Vergleich mit RNA-Molekülen bekannter Größe (RNA-Standards) , die man parallel zu den experimentellen Proben laufen lässt, bestimmt werden. Nun kann man erkennen, ob und in wie fern sich die für das Protein kodierende m-RNA des Mutanten von der des normalen Individuums unterscheidet.

[Bearbeiten] Namensherkunft

Der Name Northern Blot geht zurück auf die ältere Southern Blot Methode, in der DNA anstatt RNA geblottet wird. Der Name ist eigentlich nur ein Mikrobiologen-Scherz, da die Himmelsrichtungen nichts mit dem Verfahren zu tun haben. Die Northern Blot Methode wurde von J.C.Alwine et al 1979 für Diazobenzyloxymethyl-(DBM)-Papier eingeführt, und von P.S.Thomas wie im einfacheren Southern Blotting auf Nitrocellulose umgestellt.