Bradford-Test
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Der Bradford-Test ist eine Methode zur quantitativen Bestimmung von Proteinen, die sehr empfindlich ist (im Bereich Mikrogramm pro Milliliter).
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[Bearbeiten] Prinzip
Der Triphenylmethan-Farbstoff Coomassie-Brillant-Blau G-250 (CBBG) bildet in saurer Lösung sowohl mit den kationischen als auch den nichtpolaren, hydrophoben Seitenketten der Proteine Komplexe. Das Absorptionsspektrum der ungebundene (kationische), rotgefärbten Form hat ein Absorptionsmaximum bei 470 nm. Durch die Komplexbildung mit Proteinen wird der Farbstoff in seiner blauen, unprotonierten, anionischen Sulfatform stabilisiert, das Absorptionsspektrum verschiebt sich auf ein Absorptionsmaximum bei 595 nm. Da der Extinktionskoeffizient des Farbstoff-Protein-Komplexes außerdem sehr viel höher als der des freien Farbstoffes ist, kann die Zunahme der Absorption bei 595 nm durch die Bildung des Komplexes mit hoher Empfindlichkeit gegen das freie Farbreagens photometrisch gemessen werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung.
Das Ausmaß der Farbreaktion ist von Protein zu Protein verschieden. Deshalb ergeben sich verschiedene Proteinmengen je nach Zusammensetzung des Proteingemisches. Dies ist die Hauptschwäche der Bradfordbestimmung. Man braucht zur Berechnung deshalb eine Kalibrationslösung einer bekannten Substanz (z.B. Chymotrypsinlösung).
[Bearbeiten] Bestimmungsgrenze
Die Bestimmungsgrenze des Mikrotests beträgt 1-20 µg/ml, des Makrotests 20-200 µg/ml Protein. Salze und Saccharose haben keinen Einfluss auf das Ergebnis. Hingegen stören Detergenzien wie SDS, Harnstoff, Thioharnstoff, Reduktionsmittel wie DTT.
[Bearbeiten] Vorteile
- Schnell und preiswert
- Hochspezifisch für Proteine
- Sehr sensitiv
- Kompatibel mit einer Vielzahl von Substanzen
- Der Extinktionskoeffizent des Protein-Farbstoff-Komplexes ist über 10 Potenzen stabil (bestimmt mit Albumin)
- Farbstoff-Protein-Komplex ist für knapp eine Stunde stabil
[Bearbeiten] Nachteile
- Absorptionsspektren der beiden Coomassie-Brillant-Blau G-250 Spezien überlappen sich teilweise und machen somit eine Standardkurve unersetzlich
- Nicht-lineare Standardkurve über einen großen Bereich
- Die Empfindlichkeit für verschiedene Proteine kann weit streuen, womit die Wahl des Standards wichtig wird. Folglich kann die Methode für gereinigte Proteine unbrauchbar sein.
[Bearbeiten] Literatur
- Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254. PMID 942051 doi:10.1016/0003-2697(76)90527-3
